PCR múltiple para la detección simultánea de los genes mecA y pvl en Staphylococcus spp

Este estudio observacional descriptivo de corte transverso tuvo por objetivo estandarizar una PCR múltiple para la detección simultánea de los genes mecA y pvl en Staphylococcus spp. Se emplearon como cepas control: S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 43300 y un aislado de S. aureus portador de los genes mecA y pvl. La extracción de ADN se realizó por el método de ebullición. El límite de detección se estableció por medio de diluciones seriadas de ADN. Se determinó la aplicabilidad de la PCR múltiple testando 41 aislados de S. aureus y 51 Estafilococos coagulasa negativo (ECN) previamente caracterizados por métodos fenotípicos en noviembre del año 2009. Los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% previa tinción con bromuro de etidio. Los productos de amplificación de la PCR múltiple presentaron tamaño esperado de 533pb y 433pb para los genes mecA y pvl respectivamente, con límites de detección de hasta 0,5 ng/μL. El gen mecA se detectó en 13 (31,7%) aislados de S. aureus y en 29 (56,7%) ECN. El gen pvl se detectó en 2 (4,9%) S. aureus y no fue detectado en ECN. La presencia del gen mecA tuvo 100% de concordancia con los métodos fenotípicos. Esta técnica es una herramienta útil en la confirmación de cepas de Estafilococos meticilino resistentes e identificación del gen pvl, además de ser relativamente sencilla con la ventaja de detectar ambos genes en una sola reacción

Comparación de métodos fenotípico y genotípico en la detección de Staphylococcus aureus meticilino resistente en centros hospitalarios de Pereira.

Introducción: Staphylococcus aureus es un importante patógeno, puede causar infecciones leves de piel, hasta enfermedades con compromiso vital. La aparición de Staphylococcus aureus meticilino-resistentes, MRSA; ha aumentado su resistencia antimicrobiana, especialmente a β-lactámicos; dificultando el manejo de las infecciones, aumentando las tasas de morbi-mortalidad, convirtiéndose en un problema de salud pública.La expresión fenotípica de la resistencia suele ser heterogénea, dificultando su detección en el laboratorio por métodos convencionales; lo cual, incrementa los costos en la atención hospitalaria de infecciones por MRSA.Objetivo: Comparar métodos fenotípico y genotípico para la identificación de aislamientos hospitalarios de MRSA en  centros hospitalarios de Pereira. Métodos: A partir de aislamientos de S. aureus obtenidos de tres instituciones de salud de alta complejidad clasificadas como A, B y C; se determinó la resistencia a meticilina por concentración mínima inhibitoria en sistemas automatizados y el gen mecA  por PCR múltiple.Resultados: La prevalencia fenotípica de MRSA fue 44,4%, la institución A presentó la mayor tasa con 48,65%. La prevalencia genotípica fue 57,4%; en las instituciones A, B y C fue 55,2%, 41,7% y 75%, respectivamente, con diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).La sensibilidad y especificidad del método fenotípico fue 99,0% y 94,7%, respectivamente, frente al método gold estándar de la PCR. El índice Kappa fue 0,942 indicando un nivel de concordancia muy bueno entre métodos. Conclusión: La prevalencia de aislamientos MRSA en las instituciones de Pereira fue alta. Los índices de concordancia de los métodos fenotípicos demostraron que son confiables para el diagnóstico de infecciones por MRSA.

Comparación de métodos fenotípico y genotípico en la detección de Staphylococcus aureus meticilino resistente en centros hospitalarios de Pereira.

Introducción: Staphylococcus aureus es un importante patógeno, puede causar infecciones leves de piel, hasta enfermedades con compromiso vital. La aparición de Staphylococcus aureus meticilino-resistentes, MRSA; ha aumentado su resistencia antimicrobiana, especialmente a β-lactámicos; dificultando el manejo de las infecciones, aumentando las tasas de morbi-mortalidad, convirtiéndose en un problema de salud pública.La expresión fenotípica de la resistencia suele ser heterogénea, dificultando su detección en el laboratorio por métodos convencionales; lo cual, incrementa los costos en la atención hospitalaria de infecciones por MRSA.Objetivo: Comparar métodos fenotípico y genotípico para la identificación de aislamientos hospitalarios de MRSA en  centros hospitalarios de Pereira. Métodos: A partir de aislamientos de S. aureus obtenidos de tres instituciones de salud de alta complejidad clasificadas como A, B y C; se determinó la resistencia a meticilina por concentración mínima inhibitoria en sistemas automatizados y el gen mecA  por PCR múltiple.Resultados: La prevalencia fenotípica de MRSA fue 44,4%, la institución A presentó la mayor tasa con 48,65%. La prevalencia genotípica fue 57,4%; en las instituciones A, B y C fue 55,2%, 41,7% y 75%, respectivamente, con diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).La sensibilidad y especificidad del método fenotípico fue 99,0% y 94,7%, respectivamente, frente al método gold estándar de la PCR. El índice Kappa fue 0,942 indicando un nivel de concordancia muy bueno entre métodos. Conclusión: La prevalencia de aislamientos MRSA en las instituciones de Pereira fue alta. Los índices de concordancia de los métodos fenotípicos demostraron que son confiables para el diagnóstico de infecciones por MRSA.

Diagnóstico rápido proteómico (MALDI-TOF MS) para la determinación de bacterias resistentes a los antibióticos

Programa Oficial de Doutoramento en Ciencias da Saúde. 5007P01[Resumen] La espectrometría de masas es una técnica de análisis que permite caracterizar analitos midiendo las relaciones de masas de las moléculas analizadas. La evolución de la tecnología ha permitido llegar al MALDI-TOF MS, que es una variante que permite la detección de mezclas proteicas complejas con mínimas fragmentaciones, lo que permite su aplicación en microbiología en la identificación de microorganismos. Siguiendo con el desarrollo de nuevas aplicaciones de esta tecnología, la detección de moléculas como los antibióticos para la detección de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos es la base de esta tesis. Nos hemos basado en la aplicación de un ensayo de resistencia funcional, basado en la medida de la acción enzimática de la bacteria con mecanismos de resistencia específicos (fundamentalmente β-lactamasas) sobre el antibiótico y el seguimiento de este en el espectro de masas. Los antibióticos estudiados son β-lactámicos, incluyendo carbapenémicos y quinolonas. Hemos conseguido resultados satisfactorios en la aplicación de esta técnica tanto en bacterias aisladas en cultivo como en el hemocultivo. La principal ventaja de esta metodología es la obtención de resultados 24 h antes que los métodos fenotípicos, con bajo coste y con valores de sensibilidad y especificidad similares a los métodos moleculares.[Resumo] A espectrometría de masas é unha técnica de análise que permite caracterizar analitos medindo as relacións de masas das moléculas analizadas. A evolución da tecnoloxía permitiu chegar ao MALDI-TOF MS, que é unha variante que permite a detección de mesturas proteicas complexas con mínimas fragmentacións, o que permite a súa aplicación en microbiología na identificación de microorganismos. Seguindo co desenvolvemento de novas aplicacións desta tecnoloxía, a detección de moléculas como os antibióticos para a detección de mecanismos de resistencia aos antimicrobianos é a base desta tese. Baseámonos na aplicación dun ensaio de resistencia funcional, baseado na medida da acción enzimática da bacteria sobre o antibiótico e o seguimento deste no espectro de masas. Os antibióticos estudados son os β-lactámicos, carbapenémicos e quinolonas. Conseguimos resultados satisfactorios na aplicación desta técnica tanto en bacterias en cultivo como no hemocultivo. A principal vantaxe desta metodoloxía é a obtención de resultados 24 h antes que os métodos fenotípicos, con baixo custo e con valores de sensibilidade e especificidade similares aos métodos moleculares.[Abstract] Mass spectrometry is an analytical technique that allows analytes to be characterized by measuring the mass ratios of the molecules. Evolution of the technology has enabled getting at MALDI-TOF MS, that is variant that allows detection of complex protein mixtures with minimum fragmentations. This leads into its application in microbiology in the identification of microorganisms. Following with the development of new applications of this technology, the basis of this thesis is the detection of molecules as antibiotics for antimicrobial resistance detection. We have based our study on the application of a functional assay that measures the enzymatic activity in the antibiotic and further tracing of the mass spectrum generated. The studied antibiotics were β-lactams, carbapenems and quinolones. We have reached satisfactory results in the application of this technique either in bacterial cultures as in blood cultures. The main advantage of the methodology is the possibility of obtaining results 24 h before than phenotypic methods, with low cost and with sensitivity and specificity values in the range of molecular methods

Caracterización bacteriológica en las áreas de cirugía y quirófano del Hospital Homero Castanier Crespo, Azogues – Ecuador

Introduction: healthcare-associated infections are a worldwide problem, due to the increase in morbimortality rate, one of the main causes is transmission through inanimate surfaces. Enterobacteriaceae and Staphylococcus aureus are most prevalent in the nosocomial environment. Objective: to characterize the frequency and antimicrobial susceptibility of bacteria isolated from inanimate surfaces in the surgical and operating room area of the Homero Castanier Crespo Hospital, Azogues - Ecuador. Methodology: a cross-sectional descriptive observational study was conducted. A total of 110 samples were collected from inanimate surfaces of the surgery and operating room of the Homero Castanier Crespo hospital. Phenotypic methods were used to identify S. aureus (Mannitol Salt Agar and rhDNase) and genotypic methods such as identification genes (nucA and femB) and resistance genes (blaZ, mecA, and vanA) by endpoint PCR. Phenotypic methods were used for enterobacteria (UTIC Chromogenic Agar). For the detection of enzymes: ESBLs, AmpC, and carbapenemases, the Kirby Bauer technique was used. Results: the frequency of S. aureus was 2.72% (3/110). The 66.6% (2/3 strains) were resistant to penicillin, 33.3% (1/3 strains) to methicillin, and 100% were sensitive to vancomycin. The frequency of E. coli was 5.45% (5/110). Conclusion: the low frequency of S. aureus and E. coli isolates is since the surfaces examined correspond to the areas of the hospital that place the greatest emphasis on the application of cleaning and disinfection protocols.Introducción: las infecciones asociadas a la asistencia sanitaria constituyen un problema mundial, debido al aumento de la tasa de morbimortalidad, una de las principales causas es la transmisión mediante superficies inanimadas. Las enterobacterias y Staphylococcus aureus, son de mayor prevalencia en el ambiente nosocomial. Objetivo: caracterizar la frecuencia y susceptibilidad antimicrobiana en bacterias aisladas a partir de superficies inanimadas del área de cirugía y quirófano del hospital Homero Castanier Crespo, Azogues - Ecuador. Metodología: se realizó un estudio de tipo observacional descriptivo, de corte transversal. Se recolectaron 110 muestras de las superficies inanimadas de cirugía y quirófano del hospital Homero Castanier Crespo. Para la identificación de S. aureus se utilizó métodos fenotípicos (Manitol Salado y DNAsa) y genotípicos como: genes de identificación (nucA y femB) y genes de resistencia (blaZ, mecA y vanA) mediante PCR punto final. En tanto que, para las enterobacterias se empleó métodos fenotípicos (Agar Cromogénico UTIC). Para la detección de las enzimas: BLEE, AmpC y carbapenemasas se usó la técnica de Kirby Bauer. Resultados: la frecuencia de S. aureus fue de 2,72% (3/110). El 66,6% (2/3 cepas) fue resistente a penicilina, el 33,3% (1/3 cepas) a meticilina y el 100% fue sensible a vancomicina. La frecuencia de E. coli fue de 5,45% (5/110). Conclusión: la baja frecuencia de aislados de S. aureus y E. coli se debe a que, las superficies examinadas corresponden a las áreas del hospital que mayor énfasis hace en la aplicación de protocolos de limpieza y desinfección. Área de estudio: bacteriología

Identificación de Staphylococcus aureus a partir de queso fresco expendido en mercados y centros comerciales de la ciudad de Cuenca

Introduction: Microbial pathogens are the major cause of foodborne illness. One of the main bacterial agents is Staphylococcus aureus, and when faced with a lack of hygienic and sanitary quality during the food manufacturing process, pathological risk factors and foodborne diseases become evident. Objective: To identify the presence of Staphylococcus aureus from bulk fresh cheese sold in various municipal markets and shopping centers in Cuenca by phenotypic methods. Methodology: A descriptive and cross-sectional study was conducted between May and June 2023. A simple random sampling method was employed, resulting in the analysis of 60 bulk fresh cheese samples, with 40 samples obtained from different municipal markets and 20 samples collected from shopping malls in Cuenca, Ecuador. Sample collection, isolation, and analysis followed conventional microbiological methods and procedures. Results: It was found that 88.33% of the samples exhibited colony growth characteristics consistent with S. aureus. Biochemical tests revealed that 35.84% were catalase-positive, 15.09% were coagulase-positive, and 11.32% were DNase (deoxyribonuclease)-positive. Conclusion: There is the presence of Staphylococcus aureus in fresh cheese sold in various municipal markets Cuenca in comparison to the commercial centers whose product quality was shown to be good.Introducción: Los patógenos microbianos se consideran como la causa principal de enfermedades transmitidas por alimentos, uno de los principales agentes bacterianos es Staphylococcus aureus y frente al déficit de calidad higiénico-sanitaria durante el proceso de elaboración de un alimento se evidencian factores de riesgo patológicos y enfermedades de transmisión alimentaria. Objetivo: Identificar mediante métodos fenotípicos la presencia de Staphylococcus aureus a partir de queso fresco a granel expendido en los diferentes mercados municipales y centros comerciales de la ciudad de Cuenca. Metodología: Se realizó un estudio de tipo descriptivo y de corte transversal, entre el mes de mayo - junio del año 2023. Se desarrolló un muestreo aleatorio simple, para el cual se analizaron 60 muestras de queso fresco a granel, 40 muestras fueron obtenidas de los diferentes mercados municipales y 20 muestras recolectadas en centros comerciales de la ciudad de Cuenca - Ecuador. La recolección de muestras, el aislamiento y obtención de resultados se realizaron siguiendo métodos convencionales, según las normas y procedimientos para el análisis microbiológico. Resultados: Se detectó un 88.33% de muestras con crecimiento de colonias características de S. aureus junto con pruebas bioquímicas 35.84 % catalasa positiva, 15.09 % coagulasa positiva y 11.32% DNAsa positivo. Conclusión: Existe la presencia de Staphylococcus aureus en queso fresco expendido en diferentes mercados municipales de la ciudad de Cuenca a comparación de los centros comerciales en los que se demostró que la calidad del producto es buena. Área de estudio general: Bioquímica. Área de estudio específica: Microbiología. Tipo de estudio: Original

Resistencia a antibióticos en Staphylococcus aureus y otros Staphylococcus spp. de origen animal; implicaciones para la Salud Pública

El género Staphylococcus, está formado por un importante grupo de bacterias patógenas oportunistas y ubicuitarias, capaces de colonizar piel y mucosas, tanto de personas como de animales. Las especies con una mayor relevancia a nivel clínico, son particularmente Staphylococcus aureus y Staphylococcus intermedius/ pseudointermedius. Estos microorganismos se caracterizan, por su capacidad de transmisión de resistencia a antibióticos, fundamentalmente al grupo de los β- lactámicos, entre los que se incluye la meticilina. Las infecciones causadas por los Staphylococcus resistentes a meticilina (MRSA), son una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad de los animales de compañía. Uno de los principales problemas con el que nos encontramos, es, la repercusión que esas resistencias detectadas en el entorno veterinario, van a tener en medicina humana, ya que estos microorganismos, son potencialmente zoonóticos. Por ello, el objetivo del estudio, fue conocer la distribución de las cepas de S. aureus y de S intermedius/ pseudointermedius en animales de compañía, así como la caracterización fenotípica y genotípica de sus resistencias a antibióticos. El trabajo se completó con la valoración de la fiabilidad y grado de acuerdo existente entre las pruebas diagnósticas disponibles y utilizadas de forma habitual para detectar dichas resistencias. La metodología de trabajo se centró en el muestreo de animales de compañía con el fin de aislar e identificar la presencia de S. aureus y S. intermedius/ pseudointermedius. Estos aislamientos se completaron con la determinación de los patrones fenotípicos de resistencia a los antibióticos de mayor interés en medicina humana y veterinaria, mediante los test de Difusión en disco de Kirby Bauer (KB) y la determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs). También se caracterizaron los patrones de resistencia a –lactámicos, mediante el test de aglutinación para la proteína PBP2a (específica de cepas resistentes a aquellos antibióticos). Finalmente, aquellas cepas con patrones de resistencia fenotípica que suponían un riesgo para la Salud Pública, se tipificaron genéticamente por PCR a través de la detección directa del gen mec- A. El estudio se concluyó con la determinación de la fiabilidad de las pruebas utilizadas mediante los parámetros de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo, de los test. El grado de acuerdo entre las pruebas se definió mediante el valor Kappa. Se muestrearon un total de 135 animales, de los cuales, las especies más representadas fueron perros (71,85%), y caballos (14,81%). De las cepas identificadas, un 23,93% fueron S. aureus y un 76,06% S. intermedius/ pseudointermedius. La prevalencia de cepas de S. intermedius/ pseudointermedius fue muy elevada, mientras que en caballos, fue S. aureus el que presenta la prevalencia más alta. Los test de KB, pusieron de manifiesto, que un alto porcentaje de cepas de estafilococos presentaron resistencias a la estreptomicina (90- 100%), y un bajo porcentaje a las quinolonas (10- 25%). Se mostraron altos porcentajes de cepas resistentes a β- lactámicos en S. aureus. S. intermedius/ pseudointermedius, evidenciaron bajos porcentajes de resistencias a β- lactámicos tales como meticilina (16,36%), oxacilina (14,55%), y cefoxitina (1,82%). Mediante la determinación de las CMIs se observó que un 50% de los S. aureus, eran resistentes a penicilina, en contraste con el 0% de resistencia a vancomicina, distribución prácticamente similar a lo observado en S. intermedius/ pseudointermedius. Las proporciones de resistencia para oxacilina y amoxicilina fueron más bajas; resultados estos, que no coincidían con los obtenidos mediante el Test de KB. Un alto porcentaje de cepas fueron positivas a la presencia de la proteína PBP2a, siendo ese porcentaje similar en S. aureus (43,75%) y en S. intermedius/pseudointermedius (38,18%). Las cepas consideradas de riesgo para la Salud Pública y analizadas por PCR fueron principalmente S. intermedius/ pseudointermedius (20), estas en su mayoría fueron negativas a la presencia del gen mec- A (13) y procedentes de aislamientos de perros; de las cepas de S. aureus aisladas (8), prácticamente todas fueron positivas a la presencia de dicho gen (7). Considerando que estos son microorganismos potencialmente zoonóticos, es posible el intercambio de cepas, incluidas las resistentes a antibióticos, entre animales y personas, siendo las personas en contacto con estos animales (veterinarios, cuidadores y propietarios) el primer eslabón en la cadena de difusión del patógeno en la comunidad, pero no el único, ya que el carácter ubicuitario de Staphylococcus, le permite su persistencia en el medio. La difusión de resistencias puede comprometer las opciones terapéuticas frente a este patógeno, y favorecer la adaptación de estas bacterias en otros hospedadores, dando lugar a la aparición de nuevas enfermedades. Finalmente, los resultados del estudio ponen en evidencia, la escasa fiabilidad y grado de concordancia, de la que gozan los diferentes métodos de detección de resistencia a antibióticos utilizados habitualmente, sobre todo en el caso de S. intermedius/ pseudointermedius, hecho que complica la eficacia del tratamiento de este patógeno, así como el control de sus prevalencias por los Sistemas de Vigilancia

Prevalencia de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, aislados en trabajadores de granjas porcinas de la provincia de Pichincha 2014

Antecedentes: Staphylococcus aureus meticilino resisitente puede producir infecciones en tejidos blandos, neumonía, sepsis entre otras. Se pueden transmitir tanto en la comunidad como en el ambiente hospitalario por el contacto con una persona infectada, un objeto contaminado, y en la comunidad se añade que puede ser el resultado del hacinamiento, falta de limpieza y/o zoonosis. Objetivo: Determinar la prevalencia de Staphylococcus aureus meticilinoresistente (MRSA) en trabajadores vinculados al cuidado de ganado porcino, mediante métodos fenotípicos y genotípicos. Métodos: El aislamiento de S. aureus se realizó por inoculación de hisopados nasales, simultáneamente en CHROMagar MRSA® y agar manitol salado (MSA). Los aislamientos de MRSA fenotípicamente sospechosos en CHROMagar MRSA®, han sido sometidos para confirmación genotípica utilizando un ensayo de PCR múltiple para nuc (un gen S. aureus-específica de la especie, que codifica termonucleasa enzima), mecA (resistencia a la meticilina gen) y luk s/f (genes que codifican la toxina PVL). Además, se utilizó la detección simultánea por el sistema Vitek2® para determinar la resistencia a los agentes antimicrobianos. Resultados: La frecuencia de aislamiento de S. aureus fue de un 30,4% (35 de 115) en los cuidadores de ganado porcino. Los aislamientos de S. aureus de los humanos tenían una mayor resistencia a los siguientes antimicrobianos: penicilina G (91,4%), eritromicina (37,1%), clindamicina (31,4%) y tetraciclina (25,7%). En menor porcentaje hubo resistencia a gentamicina (11,4%) y trimetoprimasulfametoxazol (5,7%) y quinolonas (8,6%). No hubo resistencia (0%) a la rifampicina, vancomicina ni linezolid. El sistema Vitek2® informó la frecuencia de resistencia a la oxacilina (meticilina) del 20% (7/35) en S. aureus aislados en los porcicultores. Esta proporción representa la prevalencia de MRSA, del 6,08% (7/115) en la muestra calculada en los cuidadores de ganado porcino. Conclusiones: El aislamiento de S. aureus a nivel nasal es de u